8植物组织培养中经常出现的问题与解决办法

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一、褐化

概念

是指培养材料向培养基中释放褐色物质,致使培养基和培养材料变褐而死亡的现象
初代培养时容易发生,外植体在接种后,由其表面开始褐化。

原因

褐化的发生是由于植物组织中的多酚氧化酶被激活,酚类化合物被氧化形成褐色的醌类物质。醌类化合物在酪氨酸酶的作用下,与培养材料组织中的蛋白质发生聚合,引起其他酶系统失活,导致代谢紊乱,生长受阻。
1、植物种类和品种:
在不同品种间的褐变现象是不同的。由于单宁以及酚类化合物上的差异。 (木本比草本植物高)
2、生理状态:
由于外植体的生理状态不同,所以在接种后褐变程度也有所不同。一般来说,处于幼龄期的植物材料褐变程度较浅,而从已经成年的植株采收的外植体,由于含酚类物质较多,因此褐变较为严重。
3、培养基成分:
浓度过高的无机盐会使某些植物的褐变程度增加,此外,细胞分裂素的水平过高也会刺激某些外植体的多酚氧化酶的活性,从而使褐变现象加深。
4、培养条件不当:
如果光照过强、温度过高、培养时间过长等,均可使多酚氧化酶的活性提高,从而加速被培养的外植体的褐变程度。

措施防止

1、选择合适的外植体:
一般来说,最好选择生长处于旺盛的外植体,这样可以使褐化现象明显减轻。
2、合适的培养条件:
无机盐成分、植物生长物质水平、适宜温度、及时继代培养均可以减轻材料的褐变现象。
3、使用抗氧化剂:
在培养基中,使用半胱氨酸、抗坏血酸等抗氧化剂能够较为有效地避免或减轻很多外植体的褐变现象。另外使用0.1%-0.5%的活性炭对防止褐变也有较为明显的效果。
4、连续转移:
对容易褐变的材料可间隔12- 24h的培养后,再转移到新的培养基上, 这样经过连续处理7-10d后,褐变现象便会得到控制或大为减轻。

二、玻璃化

在进行植物组织培养时,经常会出现“玻璃苗”,即试管苗生长异常,叶、嫩茎呈透明或半透明水浸状,整株矮小肿胀,失绿,叶片皱缩成纵向卷伸,叶片仅有海绵组织,没有功能性气孔,脆弱易碎。这种现象称为玻璃化。
它的出现会使试管苗生长缓慢、繁殖系数有所下降。玻璃化为试管苗的生理失调或生理病变,很难继续继代培养和扩繁。成为茎尖脱毒、工厂化育苗和材料保存等方面的严重障碍,是组织培养的一大难题。

原因

1、培养基的琼脂和蔗糖浓度:负相关
2、培养温度:正相关
3、生长调节剂的浓度:高浓度细胞分裂素
4、乙烯浓度: 乙烯合成,促进玻璃化发生
5、光照:光照不足,加速玻璃化发生
6、含氮量:特别是氨态氮含量高,容易引起玻璃化发生

解决方法

1、提高培养基硬度,以降低培养基的水势;
2、减少培养基中含氮化合物的用量;
3、增加光照;
4、增加容器通风,
5、降低培养温度,进行变温培养,有助于减轻试管苗玻璃化的现象发生;
6、降低培养基中细胞分裂素含量,可以考虑加入适量脱落酸。

三、活性炭

有很强吸附作用,通常使用浓度0.5-1.0 g/L。它可以吸附非极性物质和色素等大分子物质,包括琼脂中所含的杂质,培养物分泌的酚、醌类物质以及蔗糖在高压消毒时产生5-羟甲基糖醛及激素等。
  • 在生根时有明显的促进作用。
  • 在培养基中加入0.3%活性炭,还可降低玻璃苗的产生频率,对防止产生玻璃苗有良好作用。
每毫克的活性炭能吸附100 ng左右的生长调节物质,这说明只需要极少量的活性炭就可以完全吸附培养基中的调节物质。
  • 大量的活性炭加入会削弱琼脂的凝固能力,因此要多加一些琼脂
  • 很细的活性炭也易沉淀,通常在琼脂凝固之前, 要轻轻摇动培养瓶