In brief
RNA exosome complex RNA外切体复合物 调节核RNA稳态homeostasis, synchronizing rRNA and mRNA transcription with translation使“rRNA和mRNA的转录”与“翻译”同步，促进chromatin organization
这种由RNA介导的系统性的协调RNA-mediated systematic coordination对于cellular identity and fitness细胞的身份和适应性非常重要，对于阻止细胞衰老有关键影响。
Highlights
- The RNA exosome governs nuclear ribosomal, messenger, and noncoding RNA homeostasis RNA外切体掌管了核rRNA、mRNA和ncRNA的稳态
- Dynamic RNA turnover orchestrates nuclear organization and processes 动态的RNA周转，精心策划了核组织和各种过程
- RNA exosome depletion induces nuclear RNA aggregation, impeding transcription RNA外切体的耗尽诱导了RNA的聚集、妨碍转录
- Prolonged depletion disrupts chromatin state and translation, eliciting pre-senescence 长时间的消耗使得chromatin状态紊乱、影响翻译，导致早衰（促进细胞衰老凋亡）
Summary
即使知道了individual pathways，理解cellular coordination也是一个挑战。
RNA exosome，通常在细胞衰老cellular senescence中下调，是以很多RNA作为底物的。
使用auxin-inducible system生长素可诱导的系统，我们发现在embryonic stem cells胚胎干细胞中RNA exosome的消耗，会严重影响转录组transcriptome和蛋白组proteome，causing pluripotency loss and pre-senescence onset导致多能性的丧失以及早衰的开始。
机理上，exosome depletion triggers acute nuclear RNA aggregation严重的核RNA聚集，disrupting nuclear RNA-protein equilibrium破坏核中RNA和蛋白质的平衡。
这种disturbance扰乱limits nuclear protein availability and hinders polymerase initiation and engagement, reducing gene transcription.
Concurrently, it promptly disrupts nucleolar transcription, ribosomal processes, and nuclear exporting同时，它立即破坏了核仁的转录、核糖体过程、核孔输出，resulting in a translational shutdown
Prolonged exosome depletion induces nuclear structural changes resembling senescent cells长时间的exosome消耗诱导核结构的改变，就像衰老细胞一样，包括aberrant chromatin compaction染色质压缩畸变, chromocenter disassembly染色中心解聚, and intensified heterochromatic foci加强的异染色质点
chromocenter
Chromocenters are biochemically characterized by silent epigenetic marks such as histone H3 dimethylated at lysine K9 (H3K9me2) and 5 Methyl-cytosine (5Mc)
和异染色质区域有关的部分。也称为Heterochromatic condensates
这些效应都说明了，dynamic turnover of nuclear RNA 核RNA动态的周转orchestrates crosstalk between essential processes to optimize cellular function精细调控了重要生物过程间的crosstalk，来优化功能。
Introduction
cell nucleus ⇒ central command center, housing and decoding the genome through transcription
将近一半的nuclear volume都是由chromatin染色质占据，其它部分则由高度聚集的ribonucleoprotein（RNP）占据。
转录在nucleolus中、在peri-chromatin interface染色质周边发生，产生的RNA渗透到chromatin和interchromatin space染色质间区域。
在nucleolus中，RNA pol1主导了rRNA的转录，产生40S和60S rRNA-蛋白的particle，然后这些particles被输出到cytosol，组装成80S核糖体。
在peri-chromatin染色质周围中，RNA Pol 2 产生mRNA和noncoding RNA（ncRNA）
- mRNA仅仅代表了1% Genome，但是表达非常活跃，are efficiently spliced and are exported from the nucleus to the cytosol for translation into proteins
- 相比之下，ncRNAs，起源于genome非常广的一部分，但是转录水平低，splicing少，rapid decay快速衰减，nuclear retention（核保持）
Nuclear retention refers to the process by which certain RNAs, particularly long non-coding RNAs (lncRNAs), are preferentially localized and retained within the cell nucleus rather than being exported to the cytoplasm.
多样性的ncRNA包括了：
- long noncoding RNA（lncRNA）
- RNAs derived from genomic repeats 基因组重复and regulatory hotspots调控热点，比如promoter upstream transcripts (PROMPTs)和enhancer RNAs(eRNAs)
- abortive 流产的transcripts and random RNA fragments
mRNA biogenesis coincides with transcription. mRNA的生物发生和转录是一致的。
- 当nascent RNA从在chromatin template上迁移的RNA聚合酶上产生时，和proteins组织在一起，形成heterogeneous nuclear RNP (hnRNP)，其中一些mRNA-associated hnRNP蛋白经历了额外的RNA加工、remodeling改造、protein deposition蛋白沉积，最终形成成熟的mRNA。
- 相比之下，ncRNA-associated hnRNPs（特指ncRNPs），留在核中，ncRNA在核中发生降解。
surveillance system监控系统确保了mRNA翻译的准确性：pre-mRNAs如果处理存在defects，那么就会在核中发生decay，采取了ncRNA的命运adopting a ncRNA fate。
Harmonizing RNA production, processing, degradation, and nuclear export ensures equilibrium among various RNA species (rRNA, mRNA, and ncRNA) and upholds nuclear RNA homeostasis
协调RNA的产生、处理、降解、出核，确保了RNA物种间的平衡，维持了RNA稳态。
Nuclear ncRNPs, exporting mRNPs, ribosomal subunits，are posited to form a dynamic meshwork被假设形成了一个动态网络，拓展到整个nucleoplasm，紧紧地包裹和渗透着chromatin。这一nuclear RNPs mesh提供了一个structural framework架构，支持动态的互作以及酶类的反应，potentially influencing chromatin organization and essential nuclear processes such as transcription, RNA processing, and nuclear transport.可能影响了染色质的组织和重要的核生物过程。
RNA exosome complex，通过去除external and internal transcribed spacers (ETS and ITS)加工rRNA precursor。它能够降解faulty rRNA，pre-mRNA（错误的rRNA和mRNA前体），内含子RNA（intronic RNA），多种ncRNAs（3’-5’）（包括三种RNA聚合酶的产物）
exosome的活性对于rapid turnover of nuclear ncRNAs做出了贡献，并且能够作为一种quality control mechanism质量控制机制，在rRNA和mRNA的生物合成过程中，ensuring the fidelity of functional RNA molecules.
在humans and mices，the RNA exosome complex包含了一个non-catalytic core (EXOSC1-9)，这个core与three exoribo-nucleases（核酸酶）互作：
- EXOSC10在nucleolus核仁中富集
- DIS3在nucleoplasm
- DIS3L在胞质中。
RNA exosome的活性和专一性依赖于与adaptor protein complexes的联合，比如TRAMP、NEXT、PAXT，这些复合物分别以特定的RNA为目标底物，例如pre-rRNA、nuclear ncRNA、aberrant mRNAs
保守的RNA helicase MTR4作为RNA exosome的adaptor，促进目标的降解，通过unwinding substrate RNA and promoting oligoadenylation RNA底物的解旋和寡腺苷酸化。
关键exosome components的突变，包括EXOSC2、EXOSC3、EXOSC8，已被证明与严重的neurological disorders和早衰症状相关。
然而，the molecular consequences of impaired RNA catabolism underlying pathological conditions remain largely unknown 在病理学条件下受损的RNA代谢的分子后果也相当不清楚。
之前的研究聚焦于specific aspects using slow perturbation methods 缓慢的微扰方法like knockdown or conditional knockout，这种方法take days to eliminate exosome function
例如，消耗MTR4、EXOSC3、EXOSC10、DIS3，或者一些co-factors会导致ncRNA水平的提升。
B细胞中DIS3的失活，影响DNA:RNA混合物、CTCF/cohesin binding、architectural integrity of the immunoglobulin heavy-chain locus免疫球蛋白重链位点的结构完整性。
MTR4 knockdown导致的Translational attenuation转录衰减，是由于elevated cytosolic ncRNAs 胞质ncRNAs的升高，可能与mRNA竞争核糖体结合。
不像Drosophila和yeast，RNA exosome在转录调节中的直接作用还没有在哺乳动物中得到阐明。
在yeast中，RNA exosome控制H3K9甲基化和异染色质沉默。在人和鼠细胞中，它的消耗则引起enhancer活性、chromatin accessibility、genome instability的提高
这些效应在不同物种、不同实验条件下的变化混淆了对于RNA exosome失活导致的直接且持久的后果的理解。
Pluripotent embryonic stem cells（ESCs）多能胚胎干细胞，相比于已分化的细胞，表现出非常独特的特性，包括极度活跃的Pol1和2转录，核糖体发生和翻译的提高、宏观上相对宽容的chromatin结构、显著变大的nucleoli核仁
为了探索nuclear RNA homeostasis和cellular processes之间的互作，我们建立了一个可控的针对关键exosome component EXOSC2 的protein degradation system，在mouse ESCs中，来干扰RNA代谢。
我们的发现强调了RNA代谢在维持pristine 纯净nuclear RNA environment、支持核RNA与蛋白质的delicate balance中的关键作用。这种稳态对于精细调整重要过程例如转录、核糖体生物发生、翻译、基因组组织非常重要，因此能够optimizing cellular functioning。
在这一协调过程中发生的扰乱对核以及细胞功能具有深远的影响，导致系统性的衰退systemic decline，影响多能细胞的特性compromised pluripotent cell identity，加速早衰的开始hastened pre-senescence onset。
Scientific Question
1、
the functional implications of nuclear RNA homeostasis within the RNP mesh and its impact on nuclear and cellular functions remain less understood.
RNP网络中核RNA稳态的功能含义以及核RNA稳态对于核和细胞功能的影响，目前了解不多。
2、
the molecular consequences of impaired RNA catabolism underlying pathological conditions remain largely unknown 在病理学条件下受损的RNA代谢的分子后果也相当不清楚。
3、
不像Drosophila和yeast，RNA exosome在转录调节中的直接作用还没有在哺乳动物中得到阐明。
在yeast中，RNA exosome控制H3K9甲基化和异染色质沉默。在人和鼠细胞中，它的消耗则引起enhancer活性、chromatin accessibility、genome instability的提高
这些效应在不同物种、不同实验条件下的变化混淆了对于RNA exosome失活导致的直接且持久的后果的理解。
Results
RNA exosome depletion changes ESC transcriptome and proteome, indicating pluripotency loss and pre-senescence
RNA exosome的消耗改变了胚胎干细胞（ESC）的转录组和蛋白组，暗示了其多能性的丧失和早衰的发生。
在转录和RNA decay（RNA衰变）之间维持平衡对于细胞内RNA状态的稳定、以及随后的细胞状态和功能非常重要。
我们观察到在多种细胞和疾病状态下衰老时，RNA exosome 组分和相关factors的减少。
- 培养的细胞从增殖期proliferative phase到deep senescence after 16 weeks
- 在replicative senescent human mesenchymal progenitor cells (hMPCs)间质组细胞
- fibroblasts from a patient affected by Werner syndrome (WRN)成年型早老症
- Hutchinson-Gilford progeria syndrome (HGPS)早年衰老综合征候群
以上四类都展现出了这种趋势。
为了更深入研究，我们探索了RNA turnover在维持核RNA稳态上的重要性，使用mouse ESCs，where RNA synthesis is hyperactive
EXOSC2促进S1/KH cap的形成，并且为在MTR4和RNA exosome的非催化核心之间的互作架起桥梁，在RNA降解中起到重要作用。
为了扰乱RNA exosome的功能，我们整合了一个带有tag的EXOSC2，并且使两个EXOSC2两个内源性的等位基因失活。
当加入IAA（生长素类似物）时，EXOSC2就会很快耗尽，1h后只剩50%、4h后少于10%
Minimal apoptosis少量细胞凋亡（1.6%）在20h观察到，所以我们之后的分析都将在这个时间区间内。
EXOCS2在20h耗尽和G1期细胞的增加和S期细胞的减少相一致。
并且，它也导致了nucleoside triphosphates（NTPs）的减少，which are crucial substrates for RNA synthesis.
RNA-seq分析揭示了这段时期内mRNA表达量的下降和lncRNAs的增加。
gene set enrichment analysis (GSEA)显示，高表达的ESC基因都下调了；相比之下，中内胚层mesendoderm分化相关基因表达量上调了。这种developmental genes的去抑制de-repression，被elevated binding of active epigenetic marks (H3K4me3 and H3K27ac)、enhanced chromatin accessibility、reduced binding of the repressive H3K27me3 mark所证实。
这些都说明了ESCs的多能性受到损害，与RNA exosome在restrain遏制人类ESC分化以及在多能性的chemical reprogramming中的必要性相关的报道是一致的。
另外，exosome-depleted ESCs表现出对视黄酸retinoic acid响应时受损的分化能力，与IAA处理的时长非常相关。
有趣的是，与senescence-associated secretory phenotype (SASP)相关的基因在处理20h后上调，而SEN-early down（共有1402个基因）则下调。SEN-early down这个set在衰老早期是下调的。
RT-PCR也证实了这一点，pluripotency and house-keeping genes下调，senescence markers (p21, BTG2, and PHLDA3) and differentiation genes上调表达。
与早期衰老细胞相似，ESCs depleted of exosome在很多重要生物学功能方面都下调了。
使用stable-isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC)结合mass spectrometry (MS) sequencing也发现在蛋白水平上的减少。
在4h，与proteostasis maintenance相关的蛋白短暂增加，包括翻译相关因子、蛋白折叠和运输、蛋白酶体proteasomes、胁迫响应等。
但是20h后，这样的效应消失了。
ESC分化排除了他们不朽的可能性，使他们会对衰老敏感。
缺乏leukemia inhibitory factor (LIF)时，超过10d的中等的EXOSC2缺乏会促进senescence-associated b-galactosidase (SA-b-gal)的活性。
相反的，24h的IAA wash-off能够恢复EXOSC2蛋白的水平并且恢复多能性、降低衰老marker基因的表达。
因此，严重的exosome depletion导致可逆的多能性丧失和早衰的发生。
Acute RNA exosome depletion disrupts subcellular RNA distribution
为了理解RNA exosome depletion如何干扰ESC状态，分析subcellular RNA distribution
首先分离cytosolic部分，然后使用salt and detergents分离核组分。
- 可溶的nucleoplasmic核质部分，（使用更强的biochemical extraction）捕捉了highly dynamic RNP mesh components （np）
- 然而，insoluble部分包括了chromatin和less extractable RNP mesh components （chr/RNPmesh）
RNA from these fractions underwent ribosomal rRNA depletion (ribo-minus) and RNA-seq.
We used spike-in RNA to normalize variations in cell numbers and fluctuations in total RNA levels（？？？）
在经过4h IAA处理后，ncRNAs（lncRNAs、PROMPTs、eRNAs等）都积累了，尤其是在nucleoplasm核质中，说明在exosome inactivation后ncRNAs的稳定性都增加了。
cytosolic lncRNAs增加了，但是mRNA levels则在cytosol中显著降低了。
为了分析与less extractable RNP meshwork有关的RNA，使用DNase I去除chromatin和chromatin-bound RNA。
在exosome depletion后，all mRNA and ncRNA species within the RNP meshwork增加了
并且更长的基因增加更多，说明具有偏好性，偏好于保留更长的mRNAs
因此，核RNA的急剧积累和少量ncRNA泄漏到胞质的现象表明核RNA监控功能失调，无法识别转录本和非转录本。
Nuclear RNA and protein sedimentation form larger RNP complexes
为了检验RNA-蛋白质之间的平衡：在sonicating native ESC nuclei后，通过sucrose gradient centrifugation分离了完整的核溶解产物nuclear lysates。这种方法有效地根据大小和密度分离了RNA-protein复合物。
再对离心产物进行了ribo-minus RNA-seq analysis，发现12h的EXOSC2 depletion使得total nuclear RNA levels升高。
mRNA exon和noncoding reads 都显示出一种斜的分布，朝着denser sucrose fractions
在EXOSC2-depleted nuclei中，更多的核mRNA占了比重更重的那一部分。
并且，相对于control cells，IncRNAs, PROMPTs, eRNAs等等，都主要在中间-底部的部分检测到。
Pol II proteins exhibited escalating sedimentation rates 增长的沉降率corresponding to their phosphorylation state and activity
The hypophosphorylated (hypoP) free Pol II 主要在lighter fractions里面。
serine 5-phosphorylated (S5P) initiation Pol II，动态地和promoter结合，主要在intermediate部分。
serine 2-phosphorylated (S2P) elongation Pol II，主要和chromatin结合，在lighter and heavier区域都有分布。
在exosome depletion后，hypoP和S5P Pol II都往更重的地方漂移，而S2P Pol II保持了一个广泛的分布，且中间部分略有增加。
并且，转录因子KLF4和一些RNA-binding proteins（PABPN1、PABPC1、UAP56，snRNP70, hnRNPC等），以及一些核糖体组分（RPL9、RPS3A），在heavier fractions中有明显的shift，暗示了可能存在大分子蛋白复合物的形成。
为了检查chromatin-free RNP mesh的蛋白质含量，使用DNase I处理ESC nuclei，然后分离可溶和不可溶的RNP mesh components做MS。
4h IAA处理和control相比，在不可溶的RNP mesh中富集的蛋白主要与转录和染色质重塑相关；
在增加的可溶部分中则主要与rRNA和核糖体相关功能有关。
Collectively, exosome depletion profoundly altered nuclear RNA and protein distribution.
Heterogeneous RNA aggregates form rapidly upon RNA exosome depletion
在RNA exosome depletion时，各向异性RNA聚集体快速形成
为了visualize RNA-protein 分布的变化，采用了FISH和immuno-FISH
2h IAA处理后，nuclear poly(A) RNA 信号快速增长，形成了持续、显著的聚集物。
测试的RNA-binding protein中，poly(A)-binding protein nuclear 1 (PABPN1)、the nuclear speckle marker SC35、transcription-export complex (TREX) proteins都和RNA有部分overlap
PABPN1：the sequestration of nuclear proteins in RNA aggregates 在RNA aggregates中被扣留的核蛋白。
photobleaching (FRAP) analysis光漂白分析。
而且这些RNA aggregates长得并不像nuclear speckles。可以从incomplete co-localization observed between poly(A) signals and the analyzed speckle proteins看出来。
而且，当Pol II转录被抑制时，大量的polyA foci被留在外面
使用1,6-hexanediol，an inhibitor of weak hydrophobic interactions，保留了strong poly(A) RNA signals，但是有效溶解了COILIN aggregates in Cajal bodies
suggesting charged interactions in these RNA aggregates（？？）虽然我不太清楚这个什么意思。但是应该说这些RNA aggregates的互作发生了改变。
有趣的是，即使DNase I treatment followed by thorough washes (1 M urea, 1% NP-40, and 2 M NaCl)，poly(A) signals remained conspicuous （polyA信号在不溶的RNP中依然保持很强）within the unextractable RNP mesh in EXOSC2-depleted nuclei but were barely detectable in control nuclei（但是在control里面就无法检测到了）
这些现象可能说明polyA聚集物参与了在heterogeneous RNA and protein complexes间的electrostatic interactions静电学互作
A 24-h IAA wash-off fully removed poly(A) aggregates, indicating dissolvability
IAA wash-off处理24h就能完全去除polyA，说明了其还是具有溶解性的。
Acute exosome depletion reduces Pol II availability and chromatin engagement
核RNA以及蛋白质的聚集可能改变生理环境，从而对转录过程产生影响。
Immuno-FISH显示了discrete punctate（离散小斑点） Pol II signals near poly(A) RNA signals，类似于互相联系的球面akin to interconnected spheres，加上4h IAA处理后更加明显了，即使是chromatin和其它可溶组分都没了。
为了研究pol II behaviors，使用FRAP，将荧光绑在RPB1 (the largest subunit of RNA Pol II)上，整合到AID-FBEXOSC2 ESCs中
Flavopiridol (flv) ，Pol II hyperphosphorylation的抑制剂，能够用来标记Pol II
在control ESCs中，
