原生质体(Protoplast)是指：植物细胞中除去细胞壁的裸露部分。
原生质体特点：含有全部遗传信息；能再生成完整植株；在遗传上是同质的。
优点：
1、为一些科学研究提供良好的实验体系；
2、可以直接摄取外源DNA 、细胞器、病毒、质粒等，是遗传转化的理想体系；
3、克服有性杂交的不亲和障碍， 可进行体细胞杂交等。
体细胞杂交是无性杂交，胚败育结合胚拯救是有性杂交。
第一节 植物原生质体的分离
一、原生质体分离的方法：机械法和酶解法。
（一）机械法
特点：产量低，材料受到限制
（二）酶解法
1960年 Cocking用纤维素酶从番茄幼苗根尖中分离获得原生质体。是目前广泛采用且效果最佳的原生质体分离方法。
特点：产量高、完整性好，活力强。分为两步法和一步法。
一步法就是纤维素酶和果胶酶一起。
（三）酶
1、最常用的酶是：纤维素酶和果胶酶，也有用半纤维素酶。
注意都是过滤灭菌！！
纤维素酶(Cellulase Onozuka RS)(过滤灭菌)和果胶酶(Pectorlase Y23)(过滤灭菌)
2、分离酶的特性
酶对原生质体具有一定的毒性，影响原生质体的活力
酶的活性与pH有关，常在4.7-6.0之间
酶的活性最适温度在40-50℃，而培养温度为25-30℃
二、原生质体供体材料
1、天然材料：包括田间栽培的或野生的植株、 温室或盆栽的植株等。
2、人工培养的材料：包括愈伤组织、悬浮培养组织、组织培养得来的再生植株以及种子灭菌后的在试管中萌发出来的无菌苗等。
3、选择供体材料的原则
材料具有较高的分化能力；可分离到大量有活力的原生质体；原生质体稳定性高；培养后可持续分裂。
三、原生质体分离的步骤
1、取材：产量高、活力高；
2、酶液配制：酶的种类，pH，渗透压(一般采用甘露醇)，过滤灭菌
一般不用糖，糖会慢慢被消耗掉。
3、酶解处理：0.5-1.0 g/10ml，温度，时间等
4、对于无法撕下下表皮的材料，就需要自行切割。
四、原生质体纯化
沉降法、漂浮法、不连续密度梯度离心法
五、原生质体活力测定
1、FDA法：无活力的原生质体不产生荧光
2、台盼蓝染色法：是细胞活性染料，常用于检测细胞膜的完整性，检测细胞是否存活活细胞不会被染成蓝色，而细胞膜破损或死细胞会被染成淡蓝色。
3、形态观察法：形态完整，颜色鲜艳，富含细胞质的有活力。
六、影响原生质体数量和活力的因素
1、材料(基因型、来源)
2、酶(种类、组合和酶解时间)
3、渗透压稳定剂：0.4mol/L甘露醇，渗透压太大或太小都不好
4、pH
第二节 植物原生质体的培养
一、原生质体培养方法
（一）培养方法
1、平板培养法（琼脂糖包埋）
原生质体不能放在平板表面（固体培养基上）
琼脂50℃左右时，把原生质体包入琼脂。
2、液体浅层培养法
液体培养容易导致细胞粘连，容易造成营养竞争导致细胞坏死。并且坏死后会影响其他细胞。
3、固-液结合培养法
（二）植板密度
使用细胞计数板，一般在104至105/ml之间
二、植株再生
有器官发生途径和胚状体发生途径两类。
三、影响原生质体培养的因素
（一）营养成分
原生质体是去除了细胞壁的细胞培养，因此它的要求更高。它的培养基常由细胞培养基改良而来，常用的有MS、KM8P、NT等
（二）渗透压
由于去除了细胞壁，原生质体培养必须处在一个具有渗透压的环境中。因此分离和培养原生质体要使用渗透压调节剂，常用的有：甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等。随着细胞分裂和细胞团的形成，渗透压要逐渐降低和去除（比如使用一半甘露醇和一半蔗糖，这样渗透压就能缓慢降低）。
第三节 体细胞杂交
一、原生质体融合
原生质体融合(protoplast fusion)是指通过物理或化学的方法使原生质体融合；经培养获得具有双亲全部(或部分)遗传物质的后代的方法，也称为体细胞杂交。
（一）融合原理
1、化学法融合原理
带有阴离子的PEG分子等与原生质体表面的阴离子之间在Ca2+连接下形成共同的静电键，从而促进了原生质体间的粘着和结合。
2、物理法融合原理
对融合槽的两个平行电极施加高频交流电压，产生电泳效应，使融合槽内的原生质体偶极化并沿着电场的方向排列成串珠状，再施加瞬间的高压直流脉冲，使粘合相邻的原生质体膜局部发生可逆性瞬间穿孔，然后原生质体膜连接、闭合，最终融为一体。
（二）融合类型和方法
1、融合类型
（1）对称融合
指融合时，双方原生质体均带有核基因组和细胞质基因组的全部遗传信息。亲缘关系较远的种、属间杂种细胞在发育中，由于分裂不同步，而变为不对称杂种。
（2）不对称融合
是指通过物理或化学方法处理亲本原生质体，使一方细胞核失活，或同时也使另一方细胞质基因组失活，再进行原生质体融合，获得只有一方亲本核基因的不对称杂种的技术。
形成渐渗系。
意义：特别是适用于细胞质雄性不育系的转移；另外也能在保留亲本优良性状的同时，改良其某个不良性状。
胞质杂种：利用原生质体融合技术，使两种来源不同的核外遗传成分（细胞器）与一个特定的核基因组结合在一起，这种杂种就是胞质杂种。
2、融合方法
（1）PEG（聚乙二醇）融合法
（2）PEG结合高钙——高pH法（最广泛使用）
（3）电融合法
（三）融合体的培养和发育
细胞壁再生，核融合，细胞增殖
二、体细胞杂种选择
（一）杂种细胞的选择
1、互补筛选法：激素自养型互补选择；白化互补选择；营养缺陷型互补选择；抗性突变体互补选择；基因互补选择
2、机械筛选法：天然颜色标记分离；荧光素标记分离；荧光活性自动细胞分类器分类融合体
（二）杂种细胞培养和杂种植株再生
杂种细胞培养方法与原生质体培养方法相似。
体细胞杂交后，选择系统的使用还是比较困难的，在大多数情况下，往往是不加选择，直接进行混合培养，长出植株后再进行鉴定，以确定真正的杂种
（三）杂种鉴定
形态学：利用杂种与双亲在表型上的差异进行鉴定。
细胞学：染色体观察、原位杂交等
生物化学鉴定：比较杂种与双亲在生化特征上的差异作为鉴定指标。
分子生物学：SSR、RFLP、RAPD、AFLP
（四）杂种植株
融合后的群体: 有未融合的双亲原生质体,同核体, 异核体, 和其他的核-质组合.
异核体的比例很低: 0.5%-10%
三、细胞质工程
细胞质工程(cytoplasmic engineering)：是通过物理或化学方法将细胞质与细胞核分开 再进行不同细胞间核质的重新组合，重建成新细胞。
原生质体融合涉及双亲的细胞核和细胞质。