花粉花药培养:获得单倍体,DH双单倍体
获得单倍体植株:未受精的子房、未受精的胚、花粉、花药培养等。
花药:器官培养;花粉:细胞培养
花粉花药培养主要是体细胞胚胎途径(胚状体发生途径)。
单倍体(haploid):是指具有配子染色体组成的细胞或个体
双单倍体(DH):对单倍体进行基因组加倍获得的纯合DH群体
除了花粉花药培养,通过自交也能获得双单倍体。但是花粉花药培养能够大大缩短时间。
一、植物花药和花粉培养的概念和应用
(一)花粉和花药培养的概念
花药和花粉培养都指在合成的培养基上,改变花粉的发育途径,使其不形成配子,而像体细胞一样进行分裂、分化,最终发育成完整植株。
(二)花粉和花药培养的应用
单倍体、双单倍体的利用:作物育种、 遗传分析、基因工程、分子生物学、 物种进化等方面具有重要意义;
人工诱导单倍体:花药和花粉培养是 人工诱导作物孤雄产生单倍体的关键技术;花药和花粉培养应用于诱变育种、雄核以及胚胎发育的研究。
二、花粉小孢子发育途径
花粉形成植株的途径称为“花粉孢子体”发育途径,也称为“雄核发育”。
花粉植株形态发生方式:1)胚状体发育途径(推荐);2)愈伤组织发育途径
(一)活体小孢子发育途径
花粉母细胞——四分体——营养核和生殖核——小孢子和精子
(二)离体小孢子发育途径
离体时是在单核期。
(三)雄核发育途径
不对称发育途径 (A途径):小孢子第一次有丝分裂为均等分裂,在花粉内形成一个较大的营养核和一个较小的生殖核。
A-V途径: 多核花粉由营养细胞重复分裂衍生而成;
A-G途径: 生殖细胞进行多次分裂形成胚状体;
A-VG途径: 营养细胞和生殖细胞独立分裂,形成两类细胞群;
对称发育途径 (B途径):小孢子第一次有丝分裂为均等分裂 形成两个大小相近的细胞。这两个细胞同步分裂,形成花粉胚,不同步,结果形成多倍体植株。
三、花粉和花药培养方法
尽量提高单倍体频率。
花粉培养难度更大,效果更好,但是和花药一样都是取花药离体消毒。
(一)花药培养
材料培育的方法:大田(容易污染)和温室
植株的基因型:茄科植物成效最大,特别是烟草。
花粉发育阶段:大多采用单核期的花粉培养, 诱导产生愈伤组织或胚状体的频率较高。花粉时期的确定,常采用醋酸洋红-碘化钾或荧光染色,再压片核镜检。
实际操作中常根据调查、 观察花蕾长度大小与花粉年龄的相关性来确定。
前处理:低温、高温、饥饿或交叉处理
培养基:有MS、Nitsch、 Miller、 B5和 N6。 低浓度的生长素和细胞分裂素相结合。
高浓度的蔗糖对花粉的诱导生长有一定的作用。(6%-14%)
高浓度蔗糖对二倍体器官发生有抑制作用,对单倍体诱导培养是有促进作用的。
(如果二倍体组织培养,蔗糖用3%)
另外,在培养基中加入活性炭,对提高诱导频率也有一定的效果。
(二)花粉培养
需要将花粉从花药中分离出来,调成一定的浓度,以单个花粉粒为外植体进行培养。
1、分离纯化方法
(1)自然散落法
(2)挤压法:挤压法、研磨过滤
(3)机械游离
(4)小孢子分离和纯化
2、花粉培养方式
(1)平板培养
(2)液体培养
(3)看护培养(Nurse Culture)
将亲本的愈伤组织或高密度的悬浮细胞同低密度一起培养,以促进低密度细胞生长分裂的培养方法。
(4)微室培养
(5)条件培养基培养
(三)移栽驯化
白化苗现象:没有发育完好的叶绿体,缺乏叶绿素,只在异养条件下生长,很难开花结实,禾谷类作物比例很高 (80%),成为育种障碍。
(四)影响培养的因素
- 基因型
- 植株生长条件和生理状态:光周期、光强、温度、营养
- 花粉发育时期:单核期
- 预处理:高低温处理、化学处理
- 培养基
- 培养条件
- 花药壁因素
四、单倍体植株鉴定和染色体加倍
(一)花粉和花药植株的倍性
染色体直接记数:根尖或茎尖细胞染色体计数;
间接鉴定:流式细胞仪,细胞形态,植物形态,高/低温胁迫法,杂交鉴定法,分子标记等。
(二)染色体加倍
1、茎段培养
愈伤组织生长过程有大量的二倍体产生。
2、化学试剂诱变
(1)秋水仙素诱导
浸泡法(0.2%-0.4%烟草小植株)、生长锥处理、培养基处理
(2)除草剂处理