Background
横纹肌，就是在显微镜下肌纤维呈明暗相间的横纹而得名的，典型的包括骨骼肌和心肌。
这两篇文章主要是以心肌为例子。而本背景主要是介绍骨骼肌。
Greek sarco means “flesh”. sarcolemma就是肌纤维的细胞膜；sarcoplasm就是肌细胞的细胞质。
肌肉的收缩需要肌节的收缩，也就是粗肌丝和细肌丝的相对滑动。
粗肌丝是双极的结构，包括myosin II, MyBP-C and titin，以及一些bare zone 附近的别的蛋白。
Thin (actin) and Thick (myosin) filaments
These myosin molecules assemble on a titin scaffold with their tails pointing toward the M-line. Because of this, there is a bare zone about 0.3 μm in the center of the thick filament that has no myosin heads.(Quantitative Human Physiology, 2012)
包含了P zone 和 M band。
Myosin是myosin II dimer，有heads and tails两个区域。
- heads包括motor domain, essential light chain and regulatory light chain.
- tails形成coiled-coil并插入到粗肌丝骨架中。
在肌肉松弛状态下，Myosin的头部排列成准螺旋结构，3-fold rotational symmetry
3 myosin molecules按间隔形成连续的crown，轴向上间距143A
MyBP-C是在A带的中心区域，C区，这个区域包含了所有能够在收缩时产生peak force的motors。
cMyBP-C是心脏型的MyBP-C(cardiac isoform)，有3个fibronectin type 3 (FN3)-like domains纤维连接蛋白类似域以及8个immunoglobulin-like domains免疫球蛋白类似域。在粗肌丝和细肌丝之间形成连接。
MyBP-C的氨基端可以与myosin heads或者actin结合，通过一种phosphorylation-dependent的方式。C端靠在粗肌丝上，与titin和myosin尾部互作。
MyBP-C的这种连接可以作为肌肉张力的感应器，对myosin motor具有激活或者抑制的作用，调节肌肉收缩的力度strength和动力学kinetics。
Titin包括最多169个免疫球蛋白类似域以及132个FN3-like domains，形成了一个从M带到Z disc的一个链。Z disc就是actin的另一端与-actinin结合，表明了肌节侧向的边界。
Titin形成了一个分子弹簧molecular spring，阻止肌节的过度伸展，在延伸后释放时将肌节回弹recoils，并且还作为一个molecular ruler，控制myosin在A带处（粗肌丝和细肌丝的重叠部分）的聚集。
A带里边titin的准确的化学计量还不清楚，大概2-10 molecular/thick filament。
根据它上面很多翻译后修饰的位点以及预测的与myosin和MyBP-C的互作，titin可能也是介导调节肌细胞和myosin motors的重要部分。
Questions
他们的排列情况以及动力学模型已经被很多体外试验预测了。
但是，这些观测结果如何map onto原位下的肌节以及原位下这些纤维它们是如何互作的还不清楚。
how they carry out their highly regulated functions within the confined space of the thick filament.特别是，myosin, titin and MyBP-C这些和疾病十分相关的分子，是如何在封闭的粗肌丝空间内实现高度有序的功能，也不清楚。
Main results
- 利用cryoET和cryoFIB给出了原位下小鼠心肌的粗肌丝bare zone, P zone and C zone的结构。
- 这些结构揭示了粗肌丝的结构，visualizing critical interactions between myosin, titin and MyBP-C以及MyBP-C和粗细肌丝之间的连接关系。
Results in detail
Structure of relaxed cardiac sarcomere
Method:
- 脱膜demembranated mouse cardiac myofibrils
- Mavacamten，一种治疗心肌肥大病的药物，可以稳定myosin的OFF/relaxed松弛结构
myosin的松弛结构，也就是myosin不结合细肌丝。(F1a)
通过STA，得到心肌细纤维的结构，并且此时tropomyosin原肌球蛋白是被blocked了（结合myosin的部位被堵了）。还能得到松弛的粗纤维的结构relaxed thick filament。
将结构放回tomograms中还能得到粗细肌丝的排布顺序。(F1b)
F1a: 以M带为中心。心肌肌小节的tomogram slice
F1b: 为了更加清晰，只是将阻碍观看粗肌丝的部分细肌丝去除了。
F1c: 粗肌丝的结构，从C区到M带。
F1d: tropomyosin原肌球蛋白被block的细肌丝的结构。
M带的蛋白、31myosin layers，6 titin molecules（3*2），27 molecules of cMyBP-C
直径32nm，长度510nm
myosin heads是三次旋转对称方式的准螺旋排布。
Structures of myosin, titin and cMyBP-C
F2a: 3d model of the C zone
F2b: atomic model of the C zone
由于有重复的结构，平均后得到18A的结构。使用AlphaFold2进行预测，得到原子结构模型。(F2a-b)
重构分类得到了三种不同的crown排列。从M带到Z disc命名为1、2、3，这也形成了粗纤维最外面的一层。
可以看到dimer的互作情况：在OFF状态下，blocked head折回去并且其actin-binding site被另一个head free head阻挡。这种状态和super-relaxed state相关，这时motors的ATPase活性收到很大抑制。
对于myosin tails来讲，它们在纤维中央形成了很大的一串coiled coils。在tails上，有3对平行的titin分子但是对于每一对titin而言，两个分子的构像都不一样
为了区分，将titin分为两个，一个是titin-alpha一个是beta。
从图中可以看出，crowns1和3是不会与titin互作的，但是crown2的free head会与the sixth domain of the titin C-type super-repeat结合（？），可以在cMyBP-C stripe No.1上看到（？）
cMyBP-C还会用C端domain C7-10与myosin tails结合。
C端区域还会直接和interacting heads motifs(IHMs)（也就是myosin的double heads）互作；
- C10和crown3的free head的motor结构域结合；
- C8和crown1的free head的motor结构域产生静电相互作用。
这些cMyBP-C与myosin motors的相互作用，直接说明了cMyBP-C在C zone稳定myosin OFF状态上具有直接作用，并且也说明了为什么cMyBP-C可以稳定super-relaxed state。
进一步可以说明cMyBP-C在sarcomere regulation中的重要作用，以及这也是一个对于心肌肥大病的很好的药物干扰的靶点。
Structural arrangement of myosin tails
虽然在昆虫等无脊椎动物中myosin tails已经解析过了，但是对于哺乳动物的横纹肌中的myosin tails我们也还是不清楚，也不知道其在心肌收缩方面的分子机理。
在之前得到的以430A重复的C zone结构中，只能看到部分tails，因此为了得到全部的tails我们分析了200nm的部分。这使得我们能够看到tails和对应的crowns
crown3组成了粗肌丝tails部分的核心，并且在c端相互作用。这可能说明了crown3可能在组装肌纤维时可以作为核。
为了计算tails的弯曲程度，计算了一个与tail曲率增加正相关的参数sinusoidal compression percentage，crown1/2/3分别为3.05%/4.44%/2.53%
说明crown 3还是很直的，但是crowns1和2的tail显示出波动程度的增加。箭头所示的就是一个转折点inflection point，使用AlphaFold2也预测到了这里有个苯丙氨酸残基1449
This residue does not correspond to any skip residues predicted in the coiled-coil sequence and is not present in non-mammalian myosin II
这可能揭示了哺乳动物myosin II tail的特殊结构。
在C zone 内，myosin tails也有与titin不同角度的互作关系。比如crown3和titin的互作很少，但是crown 1和titin-alpha/titin-beta都有很多互作。crown2和只和titin-beta互作。
这些说明，心肌粗肌丝的每个crown，都有着自己不同的arragement，也有着不同的互作模式。这些互作模式可能是被titin chains精细调节的，或者说每个crown也可能反过来微调不同的titin chains。这也进一步表明了每个crown可能还存在特异的length-dependent的激活和收缩功能。
crown1 和2的这种弯曲的特性，以及与titin直接互作，说明titin不仅仅只是作为molecular ruler，还能感受和传达肌肉的负载，传导可能促进transition from the super-relaxed to the disordered relaxed state of朝向M带的更上游的crowns的信号。
Variability across myosin crowns
看看在粗肌丝上的myosin heads有没有区别。
结果是所有的myosin heads都是在IHM状态，说明整个都是OFF state
crown1/2/3的这种准螺旋排列模式，在整个C zone都是保守的。
但是在靠近M带的区域，结构还是有很大区别。
P1-A9异质性很强，从A10开始才更加规律。
比如A5以及A8这两个crowns2的地方，轴向距离更大、更靠近细肌丝；free heads更朝外，beta角更负。
说明这些crowns可能在激活率、张力系数上有独特的作用。
并且对于crown2这种和titin之间的作用不强的，可能会成为第一个length-dependent的激活的反应器
结论：
- 虽然所有的myosins都是在IHM状态，但是在不同的molecular context下，它们的稳定和互作关系是通过一系列不同的互作关系进行的。
- 为了适应不同的生理条件，这些粗肌丝的myosin heads可以被各种调节机制微调。
Titin organization in the P and C zones
虽然说titin在肌小节的组装和发挥功能上很重要，但是具体的排列结构还是不清楚。
因此我们利用从P1-P3以及A1-A28这31个layers，用AlphaFold2得到了titin的原子结构。
这让我们可以得到从C zone 到M带的titin的组织结构。(F5)
另外，titin-alpha在整个粗肌丝全长都有，并且到了P zone，但是titin-beta在A1的地方突然中断了。因此在C zone，titin有6条链，但在P zone，titin只有3条。
并且titin-alpha and titin-beta之间的互作关系也不强，它们都是主要与myosin tails互作。
在P和C区里面，titin都是类似弹簧形状进行排列，形成一个3-4-4的模式。
除了这种比较common的motif, 在不同的C-type super repeats中它们的角度也是有不同变化的，尤其是在titin-beta上非常明显。这一点其实与之前提到的不同crown的可变性是十分一致的。
在P区，相当于是A和M的过渡区，主要是由7个domains(A164-A170)加上一个titin kinase(TK) domain构成的。
使用IgM的anti-TK抗体，确认TK domain的位置，大概是距离M1 line在78nm+-8nm之间。
TK domain是和邻近的m1连接，这个m1和crown P2互作，然后titin m2和m3是缠在P1 crown的尾部。
Molecular topology of the cardiac M band
M band可能有非常复杂的蛋白网络，包括结构蛋白、代谢酶等等。
可能有很多蛋白是将M区域锚定在sarcolemma上，稳定myosin纤维的六边形排列方式以及作为一种signaling scaffold，整合mechanical forces, energy balance and protein turnover
对M region进行分析，得到一个2次中心对称的结构，这个对称轴与之前的三次旋转轴是垂直的。
并且也清晰解析出了myosin crowns在P zone的完整结构，可以看出P1 tails结束于另一端的P1 crown，这两者之间反向平行。
作者认为从M4到M4’之间这部分突出的density很可能是myomesin 1, OBSL1 and possibly myomesin 2
而且他们看到在118A处有一个突起，这个突起似乎是朝着相邻的粗肌丝突起的，作者以为这是个cross-connecting M bridges，可能形成了一个myomesin 1的二聚体。但是在最后refine的过程中averaged out了，因为这个结构柔性太强了。
并且他们也无法确定OBSL1的具体位置。
titin-alpha包括了TK domain, m1-10 and 7 interspacing regions。位于427A处有一个类似两个immunoglobulin-like domains可能就是邻近的m8-9 domains。其他的小的density也可能对应着m1, m2, m3 and m10。
这些interspacing regions太小了，没有预测到二级结构，所以在最终的模型中找不着。
反正，这些应该都可以推测titin-alpha M region是在整个M band上延伸的。
提供了一个blueprint for titin m-domain localization and structural rationalization，以及一个initial model
具体的density的解析需要更多别的方法与cryoET的结合。但是至少解决了一个问题：原本的生化实验说明titin与OBSL1以及OBSL1与myomesin1都是形成1:1的complex，这里的工作说明了在M band只有titin-alpha也就是3个titins，符合1:1，推翻了之前以为在M band有6个titins的假说。
cMyBP-C links thick and thin filaments
之前也提到，cMyBP-C的C7-10会与tails互作，在粗肌丝上纵向排列，C10朝着M band，展开16nm的距离，位于titin C-type super-repeats的interface上。
之前的生化实验认为cMyBP-C只在C zone出现（也就是说限制cMyBP-C在C zone）可能是由于C7-C10与titin C-type super-repeats有直接相互作用。但是在relaxed state上，作者没有发现cMyBP-C与titin的任何直接互作。
作者发现，是C7-10与myosin tails的特殊构型结合，导致了cMyBP-C只在C zone出现
具体而言，C7-10与crown2的尾部以强烈的静电相互作用结合。
This configuration also resolves the absence of cMyBP-C in the titin region of titin C-type super-repeat 1, as the site where cMyBP-C would bind is in this case composed of tails of the D-type super-repeat 6, which we have not resolved in our structure, but which probably have a different conformation.（？）
C7应该是一个支点pivot point，因为它伸出并最远离粗肌丝。bridging region非常flexible，很难获得density。
虽然stripe no.1/2显示了有bias，但是cMyBP-C N端可以与两个相邻的细肌丝其中之一结合。
并且no.2显示，crown A7的free head不是被cMyBP-C C8稳定的，而是被临近crown的myosin light chain稳定的。
并且直接验证了cMyBP-C links的灵活性以及能够直接与细肌丝互作。但是作者无法解析到N-terminal region on the thin filament，可能是异质性太强了。
存在由 3 至 4 个结构域形成的系链，这些结构域以 43nm 的间隔和高度的灵活性混合在细丝的信号中。因此，链接的灵活性可能可以适应细肌丝中 37nm 的肌动蛋白重复序列和粗肌丝中 43nm 的 cMyBP-C 重复序列的不匹配。
Of note, the thin filament with bound N-terminal cMyBP-C domains appears in the OFF state, suggesting that cMyBP-C, at physiological phosphorylation levels and in the absence of myosin cross-bridges, is not a thin filament activator.在生理磷酸化水平和肌球蛋白交叉桥缺失的情况下，cMyBP-C 并不是细肌丝激活剂
总结，cMyBP-C的多种作用：
- 与细肌丝的相互作用可以感知细肌丝的伸展与滑动，并将张力传递给cMyBP-C，而C1和C0可能会进一步伸展结合粗肌丝表面的myosin light chains；
- 与crown 1和crown 3的结合可能使得它能够作为另一种与细肌丝无关的、感受粗肌丝内部的张力的传感器。
