MB5

一、Term 二、基因功能研究方法（一）Gene expression基因表达 1、Reporter gene transcription(利用启动子融合报告基因)2、RNA-Seq 3、Quantitative RT-PCR (定量RT-PCR)4、cDNA microarray(基因表达谱芯片)（二）site-directed mutagenesis in vitro by PCR (体外基因定点突变)1、Site-directed mutagenesis by overlap extension重叠延伸诱变法 2、Site-Directed Mutagenesis In Vitro by Megaprimer PCR大引物诱变法 3、Approaches for gene edit in transgenic organism转基因生物的基因编辑（1）Gene knock-out by homologous recombination同源重组 in animal基因敲除（2）Screen T-DNA insertiaonal lines in mutant library for gene knock-out plant （3）RNAi(RNA interference, RNA干涉)技术及其应用 4、New approaches of genome-editing technologies 三、Pr-DNA互作研究 1、Yeast one-hybrid system酵母单杂交 2、EMSA (Electromobility Shift Assays)凝胶迁移滞后 3、Chromatin immuno precipitation染色质免疫共沉淀Chip 四、体外蛋白质相互作用技术In vitro protein interaction methods 1、Far Western印迹技术 2、GST Pull down 融合蛋白沉降技术 3、Protein microarray 蛋白质芯片技术 4、surface plamon resonance technology, SPR等离子表面共振技术 5、Protein interaction test in Yeast(Yeast two-hybrid system) 酵母双杂交系统 6、Co-immunoprecipitation(Co-IP) 免疫共沉淀技术 7、Affinity-purification of protein complexes combined to Mass Spectrometry结合质谱分析亲和纯化Pr复合体 8、Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET—荧光共振能量转移法(FRET)9、Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)双分子荧光互补

一、Term

Green fluorescent protein：GFP绿色荧光蛋白

Transcriptomics转录组学

RNA-Seq，RNA测序，转录组测序

Quantitative RT-PCR (定量RT-PCR)

cDNA microarray(基因表达谱芯片)

site-directed mutagenesis定点突变

transgenic organism转基因生物

Forward genetics(正向遗传学，经典遗传学)：突变体—发现基因

Reverse genetics(反向遗传学，现代遗传学)：人工突变基因—研究功能

homologous recombination同源重组

transgenes转基因

PNS法：正负筛选法

RNAi：RNA干涉

co-suppression共抑制

small interfering RNA：siRNA小干扰RNA

miRNA：microRNA，小RNA

transcriptional gene silencing, or TGS转录基因沉默

proto-spacer adjacent motif (PAM)原间隔序列相邻模块

DSB(Double Strand Break)

Indel(including insertions or deletions)插入或缺失一段

HDR (homologous recombination)同源重组

Cas13 family proteins mediated RNA Knockdown

cis-element顺式元件

general transciption factors 通用转录因子

Tanscription factor转录因子

enhancer 增强子

Mediator 中介子

Yeast one-hybrid system酵母单杂交

EMSA (Electromobility Shift Assays)凝胶迁移滞后

Chromatin immuno precipitation染色体免疫共沉淀（in vivo）

GST Pull down 融合蛋白沉降技术

Protein microarray 蛋白质芯片技术

surface plamon resonance technology, SPR等离子表面共振技术

Yeast two-hybrid system酵母双杂交系统

Co-immunoprecipitation(Co-IP) 免疫共沉淀技术

Affinity-purification of protein complexes combined to Mass Spectrometry结合质谱分析亲和纯化Pr复合体

Fluorescence Resonance Energy Transfer 荧光共振能量转移法(FRET)

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)双分子荧光互补

二、基因功能研究方法

（一）Gene expression基因表达

1、Reporter gene transcription(利用启动子融合报告基因)

常用启动子：GUS (uidA) (b -glucuronidase, 葡萄糖甘酶); luc (luciferase,荧光素酶 ); GFP (Green fluorescent protein, 绿色荧光蛋白)

2、RNA-Seq

RNA测序，转录组测序: a revolutionary tool for transcriptomics

3、Quantitative RT-PCR (定量RT-PCR)

mRNA-cDNA-PCR

4、cDNA microarray(基因表达谱芯片)

（二）site-directed mutagenesis in vitro by PCR (体外基因定点突变)

表达感兴趣蛋白时想要对蛋白的某些位点进行突变研究

1、Site-directed mutagenesis by overlap extension重叠延伸诱变法

2、Site-Directed Mutagenesis In Vitro by Megaprimer PCR大引物诱变法

3、Approaches for gene edit in transgenic organism转基因生物的基因编辑

（1）Gene knock-out by homologous recombination同源重组 in animal基因敲除

（2）Screen T-DNA insertiaonal lines in mutant library for gene knock-out plant

筛选T-DNA随机插入库

（3）RNAi(RNA interference, RNA干涉)技术及其应用

post-transcriptional gene silencing：PTGS转录后沉默

直接作用的物质：siRNA

siRNA can be involved in histone methylation, and the resulting heterochromatin formation and gene silencing.异染色质形成和基因沉默----- (transcriptional gene silencing, or TGS)

RNAi载体构建策略：头-尾-spacer-尾-头

4、New approaches of genome-editing technologies

zinc-finger nucleases(ZFNs) 锌指核酸酶

transcription activator-like effector nucleases

(TALENs) 类转录激活因子效应物核酸酶

CRISPR/Cas-based RNA-guided DNA endonucleases

对于不同的靶基因，ZFNs 和 TALENs需要合成特异的蛋白酶复合体特异靶向基因序列， CRISPR/Cas只需要合成一段 gRNA序列即可特异结合靶基因

clustered regulatory interspaced short palindromic repeats (CRISPR)

(Cas: CRISPR associated proteins)-based RNA-guided DNA endonucleases

规律性成簇间隔短回文重复及其伴侣因子

CRISPR/Cas系统特点

1）产生DSB(Double Strand Break)，通过HDR (homologous recombination) 或NHEJ (non-homologous end joining) 进行修复，可能产生 Indel(including insertions or deletions )修饰

2）效率效率更高,精确度高，脱靶率相对低。 CRISPR-Cas系统甚至可以一次性修饰多个基因位点 ;

3）Cas蛋白不具有特异性，只需合成一个sgRNA，实现对基因的特异性修饰，更加简便

4）Cas9蛋白作用于靶序列不会受到DNA甲基化的影响，无论甲基化是在PAM元件中还是靶序列中。