第一节 植物脱毒技术
一、植物病毒危害及脱病毒机理
1、植物病毒的发现
郁金香杂色病(tulip break)是最早记载的(1576年)植物病毒病。
病毒粒体形态：球状、杆状、复杂颗粒
病毒举例：烟草花叶病毒、马铃薯病毒、玉米条纹病毒
2、植物病毒病的症状
植物感染病毒后表现不同的症状，如矮化、着色呈花叶或黄化、卷曲、波浪状、产量急剧下降等。
还有郁金香杂色病。
3*、植物病毒的传播
植物可以把病毒传染给相邻的植物，可以通过花粉，机械伤害，人类的活动而传播。
（1）介体传播：昆虫传播、螨类传播、土壤中的介体
（2）非介体传播：机械传播(汁液接触传播)、无性繁殖材料和嫁接传播（嫁接可以传播任何种类的病毒）、种子和花粉传播（种子带毒的危害主要表现在早期侵染和远距离传播）。
4、果树病毒的传播途径
1) 通过昆虫和螨类传播 2) 通过花粉和种子传播 3) 菟丝子传播4) 汁液传播5) 通过营养繁殖材料传播 6) 果树根系结合传毒
5、植物病毒传播特点
超过50%的植物病毒可以通过动物、微生物和昆虫传播。
6、病毒在植物体内的分布特点
植物病毒具有系统侵染的特点，在植物体内除生长点外的各个部位均可带毒。
不同种类、品种、个体、器官、组织都存在较大差异。
7、病毒的运输
通过胞间连丝、韧皮部等植物本身的运输系统扩散病毒。
8*、脱毒的意义
- 无性繁殖作物长期营养繁殖，导致病毒侵染、体内积累，进而种性退化，产量、品质降低，甚至死亡；
- 通过茎尖培养获得无病毒种苗，对退化品种进行提纯、复壮；
- 提高产量和品质，如马铃薯脱毒增产30-60%；
- 减少农药使用，保护生态环境：脱毒技术主要应用于各种无性繁殖植物，如草莓、马铃薯、甘薯、苹果、 香蕉、 甘蔗等。
二、植物脱毒方法
物理方法：热处理、冷冻疗法
化学方法
生物方法：茎尖脱毒法；愈伤组织脱毒法；微体嫁接离体营养脱毒法；珠心组织脱毒法
（一）物理方法
1、热处理脱毒
利用高温控制病毒扩散和抑制病毒增殖，使植物的生长速度超过病毒的扩散速度，从而得到一小部分不含病毒或者含量很少的分生组织，进行无病毒个体发育。
原理：某些病毒对高温敏感，受热后钝化失活而无法进行增殖。
适用范围：适用于对热敏感的病毒
热处理方法：热水浸泡、高温空气处理
但因其脱毒率较低，有些病毒很难用单一热处理脱毒， 因此，采用热处理和茎尖培养相结合脱除病毒，其效果远高于单纯的热处理脱毒。
热水浸泡 | 高温空气处理 |
50度热水中浸泡数分钟或数小时，即可
消除病毒 | 放在35-40度条件下生长发育，处理时间因病毒种类而异 |
方法简便，但材料易受损伤。到55度时则大多数植物材料会被杀死。 | 该法处理茎尖效果比较好，既能消除病毒，又可以减少植物死亡。 |
甘蔗、木本植物、休眠芽 | 旺盛生长的植物材料(如茎尖) |
2、冷冻疗法
利用超低温冷冻技术处理植物的离体茎尖组织，使其脱除病毒的方法。
（二）化学方法
在茎尖或原生质体的培养过程中，在培养基中加入抗病毒物质，可以脱去植物体内的病毒。
常用药剂:抗病毒醚、 2-硫尿嘧啶、放线菌酮、放线菌素-D、碱性孔雀绿等。
抗病毒药剂的效果因病毒种类而异，并且不可能除去所有病毒；使用不当还会出现药害。
（三）生物学方法
1、茎尖培养脱毒
White(1943)首先发现在感染烟草花叶病毒的烟草植株生长点附近，病毒的浓度很低或没有病毒，病毒含量随植株部位及年龄而异。
茎尖培养脱毒原理：
在植物体内，病毒分布不均：成熟的组织和器官病毒含量比较高；而幼嫩的组织和器官病毒含量比较低；越靠近顶端区域，带毒越少，顶端分生组织(0.2-0.5 mm)不带或含毒量极低。
生长点病毒少的可能原因：
（1）植物病毒自身不具有主动转移的能力。
- 病毒可以通过维管束组织长距离快速转移，但分生组织中不存在维管束。
- 病毒通过胞间连丝在细胞间移动，速度很慢，难以追赶上活跃生长的茎尖。
（2）在旺盛分裂的细胞中，代谢活性很高，使病毒无法复制。
（3）在植物体内可能存在病毒钝化系统，它在分生组织中具有更高的活性。
（4）在茎尖中存在高水平的内源激素，可以抑制病毒的增殖。
（5）适用范围：可以消除病毒、类病毒、类菌质体、细菌和真菌等病原物。
茎尖分生组织脱毒基本程序：
培养基选择和制备，带毒材料的表面灭菌，茎尖分生组织分离、接种和培养，诱导芽分化和小植株增殖，诱导生根、驯化移栽
影响茎尖培养脱毒的因素：
（1）培养基
选用适宜的茎尖培养的培养基；
选用适宜的植物生长调节物质（生长素、细胞分裂素、赤霉素）。
（2）外植体大小
- 不同植物以及一种植物要脱去不同的病毒所需茎尖大小是不同的；
- 茎尖越小，脱毒效果越好；
- 茎尖越小，成活率越低；
- 一般切取0.2~0.3mm长，带一两个叶原基的茎尖作为材料效果比较好。
茎尖应小到足以根除病毒，大到足以发育成一个完整的植株。
（3）培养条件
不同植物茎尖培养条件不完全相同。
（4）外植体生理状态
1）茎尖最好取自生长活跃的顶芽：
通常顶芽的效果比腋芽效果好。在顶芽数量有限时，也可以取腋芽为材料。
2）春季和夏季活跃生长时期的芽好于秋冬时期的休眠芽。
2、愈伤组织培养消毒
通过植物各部位器官和组织的培养去分化诱导产生愈伤组织，然后，从愈伤组织再分化产生不定芽，长成小植株，可得到无病毒苗。
并非所有的愈伤组织细胞都带病毒；在愈伤组织的培养过程中，和其它组织材料在不断继代过程中，病原会逐渐消失或随着组织继代分离的而被分离开。
3、微体嫁接脱毒(micrografting)
把极小的茎尖(<0.2 mm)作为接穗，嫁接到无菌实生砧木上(实生苗通常不带毒)，继续进行试管培养，愈合成为完整的植株。
优点：解决过小的难于培养的茎尖；解决生根难的问题。
缺点：技术难度大
成活关键：
茎尖大小：无病毒植株获得与接穗茎尖大小呈负相关；
茎尖分生组织小于0.2 mm可脱除多数病毒。
4、珠心组织培养脱毒法
病毒是通过维管束组织转移的，而珠心组织与维管束组织没有直接联系。
柑橘、葡萄等可以通过珠心组织培养获得无脱毒植株。
5、其他组织培养脱毒
包括原生质体培养、花粉培养、胚培养等，均有脱毒的作用。
6、综合脱毒方法
1）茎尖培养结合热处理脱毒法
2）茎尖培养结合病毒钝化剂处理脱毒法
三、脱病毒植株的检测
直接观察法、指示植物法、血清检测法、核酸检测法、电子显微镜鉴定法
1、指示植物法
这是利用病毒在其他植物上产生的枯斑作为鉴别病毒种类的标准。
指示植物：专门选用以产生局部病斑的寄主。
一般有两类：接种后产生系统性症状，病毒可以扩展到植物非接种部位；另一种是只产生局部病斑，常表现出坏死、退绿。
病毒的寄主范围不同，所以应根据不同的病毒选择适合的指示植物。
有涂抹法和嫁接法两种。嫁接法常用于草莓、果树及其他多年生木本植物。
适用于鉴定靠汁液传播的病毒
2、血清检测法
利用抗原-抗体特异性反应原理进行病毒鉴定。
抗血清：含有抗体的血清。
血清反应：抗原和抗体所引起的凝集或沉淀反应。
用已知病毒的抗血清(antiserum)鉴定未知病毒。并且还能够利用高度特异性鉴定病毒种类。
酶联免疫法(ELISA): 将抗原固定在支持物上，加入待检血清，然后加入酶(过氧化物酶或碱性磷酸酶)标记抗体，使待检血清不对应抗原的特异性抗体结合，最后用分光光度计进行诊断。
3、核酸检测法
RT-PCR：将病毒RNA反转录成cDNA，PCR扩增检测。
技术灵敏，已用于大蒜、萝卜脱毒苗检测。
4、电镜检测法
通过电子显微镜能够看到细胞内有无病毒粒子的存在，并可以观察到病毒粒子的大小，形状和结构。
四、脱病毒植株的保存
脱病毒植株并不具备额外的抗病性，可被重新感染。
在繁殖时，严禁再次感染病毒。
保存方法：
在隔离条件下保存：专用的防虫网室或温室；
脱病毒试管苗离体保存。
第二节 植物快繁技术
植物快繁，又称植物离体繁殖(propagation in vitro)、植物微繁 (micropropagation)：
是指利用植物组织培养技术对外植体进行离体培养，使其在短期内获得遗传性一致的大量再生植株的方法。
器官形成 (organogenesis)：愈伤组织的不同部位分别形成不定根和不定芽。
体细胞胚胎发生(somatic embryogenesis)：在愈伤组织的表面或内部形成类 似于合子胚的结构，即胚状体 (embryoid)。
植物组织培养（Tissue Culture）：通过无菌操作分离植物体的一部分，即外植体（explants）接种到人工培养基（medium），在人工控制的条件下（包括营养、激素、温度、光照等）进行培养，使其产生完整植株的过程。
外植体（Explants）：
愈伤组织（Callus）：
组织培养的原理：
细胞全能性（Totipotency）：
脱分化（dedifferentiation）：
再分化（redifferentiation）：
植物快繁的特点：
1、培养条件可以人为控制：不受地区、季节限制；人工培养基、小气候环境条件；占用空间小
2、生长周期短，繁殖效率高
3、管理方便，利于工厂化生产和自动化控制
人为提供一定的温度、光照、湿度、营养、激素等条件；利于高度集约化和高密度工厂化生产；利于自动化控制生产
一、植物快繁器官形成方式
短枝发生型、丛生芽发生型、不定芽发生型、胚状体发生型、原球茎发生型
（一）短枝发生型：能一次成苗，遗传性状稳定，培养过程简单，移栽成活率高
（二）丛生芽发生型：遗传性状稳定；繁殖系数高
（三）不定芽发生型：遗传稳定性差；有嵌合体和多倍体发生
（四）胚状体发生型：无性系变异小；成苗快；数量大
（五）原球茎发生型：兰科植物
二、植物快繁的程序
（一）无菌培养体系的建立：取材，灭菌，生长
（二）繁殖体增殖
（三）芽苗生根
离体生根：生根培养基，一般是低盐培养基，含NAA、IBA
活体生根：生长素浸蘸，移入培养机制，在高湿条件下生根
（四）小植株的移栽驯化
炼苗、移栽、驯化管理
在生根的试管苗阶段，就可以逐步开盖驯化；
移入温室后，保持高湿条件，如喷雾、覆膜等；
光照逐渐增强。
三、影响植物快繁的因素
（一）外植体
外植体的来源：选择具有拟分生组织细胞的外植体(茎尖、带芽茎段)
外植体的生理年龄：沿植物主轴，越近下部生理发育年龄越小，再生能力强
外植体的大小
（二）培养基
1、基本培养基的选择
2、植物生长调节物质
- 高浓度细胞分裂素和低浓度生长素, 有利于侧芽萌发和丛生芽形成
- 低浓度细胞分裂素和高浓度生长素, 有利于生根
- 在不定胚的诱导中, 2,4-D和玉米素配合使用
- ABA、多效唑(PP333)、矮壮素(CCC)等植物生长调节剂，促进试管苗生根、壮苗和提高成活率
3、培养基的物理性质
液体培养基 vs 固体培养基
兰科植物原球茎/不定胚培养，液体振荡培养
（三）培养条件
1、光照
注意调节光周期，避免植物开花；
调节光强，促进节间伸长，加快繁殖代数；
适当利用自然光，减少能耗。
2、温度
3、湿度
4、气体条件
5、控制污染
（四）继代培养
提高继代代数，可以增加繁殖数量
（五）移栽
根系结构、叶表组织、驯化情况、重新利用新生叶片
四、植物快繁的商业化应用
（一）商业化规模生产及工艺流程
1、试管苗生产规模的确定
2、商业化实验室的设计
3、商业化生产的配套设施
4、商业化生产的工艺流程
（二）商业化生产及效益分析
1、试管苗增值率的估算
2、生产计划的制定和实施
3、产品质量监控
4、商业化生产效益分析
（三）降低商业化成本的措施
1、提高劳动生产率
2、减少设备投资，延长使用寿命
3、降低消耗
4、降低污染，提高繁殖率和成活率
5、简化培养基
（四）商业化生产中的常见问题
1、污染问题：灭菌不彻底；操作不规范；环境不清洁
2、遗传稳定性：基因型；继代次数；器官发生方式
3、玻璃化
4、褐化
5、黄化：培养基成分；培养条件；pH；抗生素