目录
第一节 实验室及基本设备
一、实验室布局
准备室、无菌室（接种室）、培养室、驯化室（温室）
1、准备室：洗涤室、药品室、称量室、灭菌室
进行一些常规的实验操作；器具的清洗、干燥和保存；培养基的配制和灭菌；蒸馏水的生产；常规的生理生化分析
2、无菌室：进行植物材料的消毒、接种以及培养物的继代转移操作的场所
无菌室的维护：定期消毒、紫外光灯
3、培养室：接种后的材料通常放在培养室中进行培养，使其生长分化。
一般参数：培养温度25℃，光强3000-4000lux，光照强度10-16h，保持湿度70-80%
4、温室（驯化室）
在温室栽培材料，供植物组织培养取材用。
为植物组织培养提供健康的植物材料，从而使初代培养的污染得到很好的控制。
为试管苗的生产化提供良好的炼苗场所和生产基地。
二、基本仪器设备
1、玻璃器皿
2、器械类
镊子类、解剖刀、接种针、细菌过滤器
3、仪器设备
超净工作台、高压蒸汽灭菌锅
烘箱（干热灭菌）、培养用仪器设备、药品贮存和配制仪器设备
培养架、观察分析仪器设备、照相设备、组织切片设备、离心机等其它仪器设备
第二节 基本操作
一、洗涤
1、重铬酸钾洗液/无磷中性洗涤剂洗净法
一般的玻璃器皿在用重铬酸钾洗液浸泡之前，应先用水洗净；晾干后再放入重铬酸钾洗液中，浸泡一夜；第二天取出用自来水冲洗后，再用蒸馏水冲洗。
2、超声波洗净法
对比较顽固的污垢也十分有效。
3、杂菌污染的玻璃器皿必须经过121℃高压蒸汽灭菌后，再清洗。不要直接用水清洗，否则会造成培养环境的污染。
二、灭菌
（一）器具的灭菌
1、干热灭菌法：
在150℃的恒温干燥箱内保温两个小时，取出冷却后便可以使用。
2、高压蒸汽灭菌法：
一般在121℃下保持15-20min，即可达到灭菌效果。
（二）培养基的灭菌
1、高压灭菌法
放在高压灭菌锅内灭菌，一般在121℃下保持15-20min
2、过滤除菌法
当培养基中含有高温下易分解或者变性的物质时，如生长调节物质、酶等，可以采用过滤灭菌方法进行除菌。
3、部分除菌法（两者结合）
先将高温下易被破坏的有机成分配制成水溶液，进行过滤除菌后放在超净工作台内。
培养基中的其他成分按照正常方法配制并进行高压灭菌，将二者在超净工作台内配合、定容后分装。
三、无菌操作
1、提前打开紫外30min杀菌
2、超净工作台酒精消毒、进入工作台的实验材料/器具/手也要消毒
3、移植材料前后，瓶口都要在酒精灯火焰上烧烤灭菌
4、镊子、解剖刀使用后及时灭菌
5、材料切割和移植时，所有操作始终无菌
第三节 培养基
一、培养基的成分
水分、无机盐、有机营养成分、植物生长调节物质、琼脂、pH值、抗褐变物质等
（一）水分
常用蒸馏水来配制培养基，而最为理想的水应该是纯水。因为需要精准配制培养基，所以最好使用纯水。
如果要使用自来水的话，最好将自来水煮沸，经过冷却沉淀后使用。
（二）无机营养物
- 大量元素：碳、氢、氧、氮、磷、钾、 硫、钙、氯和镁。
它们是植物细胞中构成核酸、蛋白质、酶系统、叶绿体以及生物膜所必不可少的元素。氮元素可以有两种形态：即硝态氮和铵态氮。硝态氮通常以硝酸铵(NH4NO3)、硝 酸钾(KNO3)的形式添加。
- 微量元素：铁、硼、锰、锌、钴、钼、铜等。
需要量很少，一般大多为10-5-10-7mol/L，稍多则产生毒害，铁对叶绿素的合成以及延 长生长起重要作用，通常以硫酸亚铁与 EDTA螯合物的形式出现在培养基中。
（三）有机营养成分
1、碳源及能源
糖类：蔗糖、葡萄糖、果糖和麦芽糖等。蔗糖用得最多，效果也最好。
糖的添加浓度：以添加浓度30g/L较多。
无糖培养：微繁殖技术，又称光自养繁殖技术
2、维生素类
盐酸硫胺素(Vit.B1) 、盐酸吡哆辛(Vit.B6)、烟酸、生物素、维生素C，肌醇(环已六醇)
3、氨基酸及有机添加物
氨基酸及其酰胺类物质；还有水解酪蛋白(CH)和水解乳蛋白(LH)；天然有机物：椰子乳、番茄汁、酵母提取物（0.5%）。
（四）植物生长调节剂
植物生长调节剂在植物组织培养中起着极其关键的作用。用量虽然微小，但作用很大。生长素类、细胞分裂素类、赤霉素（GA3）、脱落酸（ABA）、乙烯
（1）生长素类
- 萘乙酸（NAA）：使用最广泛，可以高温灭菌
- 2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）：强烈诱导愈伤组织，在水稻、木本植物、胚性细胞中用的多，脱分化，一般不用于生根
- 吲哚乙酸（IAA）：茎尖合成、向下运输，见光分解，高温灭菌易破坏；可用来诱导愈伤组织
- 吲哚丁酸（IBA）：常用于生根，效果最好，不诱导愈伤组织
诱导愈伤组织强弱顺序为：2,4-D>NAA>IBA>IAA
浓度范围大都在10-7-10-5mol/L
作用：
- 促进细胞生长和生根的作用；
- 在植物组培中，生长素在诱导愈伤组织形成与生根方面起着重要作用；
- 2,4-D在某些植物组织培养中，还会诱导不定胚的形成；
- 生长素与细胞分裂素配合使用，对于器官形成和植株再生可以起到调控作用。
（2）细胞分裂素
激动素（KT）
玉米素（ZT）：以前是茎尖提取的，价格较贵，高温灭菌易破坏；根尖合成、向上运输；
6-苄基腺嘌呤（6-BA）、2-异戊烯腺嘌呤（2-iP）、噻重氮苯基脲（TDZ）
使用浓度范围在10-7-10-5mol/L
强弱顺序为TDZ>ZT>2-iP>6-BA>KT
细胞分裂素的作用：
- 促进细胞分裂与器官分化，促进侧芽分化与生长，抑制顶端优势，延缓组织衰老；
- 培养基中主要是促进细胞分裂；
- 诱导愈伤组织、不定芽和不定胚的产生；
- 高浓度的细胞分裂素会抑制根的产生。
（3）赤霉素和脱落酸
- 赤霉素(GA3)种类多，在培养基中添加的主要是GA3。其作用有促进细胞生长和打破休眠。一般情况下，在器官形成后表现了良好的促进作用。
- 脱落酸(ABA)有抑制植物生长，促进休眠的作用。在种质资源超低温冷冻保存时，可以用ABA来促使植物停止生长和抗寒性形成，以使冻结保存获得成功。
（4）其他类
- 多胺(polyamines, PA)：调控不定器官和胚状体发生发育，促进原生质体分裂与细胞形成。
- 多效唑(PP333)：促进分蘖，壮苗等。
另外还有油菜素内酯(BR)，茉莉酸及其甲酯(JA)，水杨酸(SA)等。
（五）琼脂（Agar）
- 培养基分为：固体培养基和液体培养基；
- 最常用的凝固剂是琼脂，不提供营养。熔点95度，40度以下开始凝固，在一般情况下，纯净度高，含杂质少的琼脂，用量一般在6-10 g/L；
- 浓度高，培养基变硬；浓度低，培养材料不容易固定。
- 培养基pH偏低时，则琼脂用量要增加。因为pH偏低时培养基凝固会变慢。
- 加热时间过长，温度过高均会影响其凝固性。
- 琼脂粉(agarose)：价格高、透明度好，用量少，原生质体培养用。
（六）pH值
- 培养基在灭菌前，pH值一般被调节到5.0-6.0之间，最常见的为5.7-5.8。
- 在调整pH时，常用1M或0.1M NaOH或HCl来进行。
- 当pH过高时，培养基会变硬；
- pH过低时会影响培养基的凝固。
（七）其它添加物
有时为了减少外植体的褐变，需要向培养基中加入一些防止褐化的物质，如活性炭(active carbon)、维生素C等。
- 在培养灭菌比较困难的植物材料时，也可以添加一些抗生素(antibiotics)，以此来抑制杂菌生长。有青霉素、链霉素等。
- 硝酸银：抑制乙烯活性的作用，促进器官或体细胞胚胎发生。
二、培养基的选择
培养基几个基本类型：
1、MS培养基（高盐成分培养基）
其主要特点是无机盐浓度高，特别是硝酸盐、钾离子和铵离子含量均较高。其代表是MS培养基（Murashige and Skoog）。元素平衡较好，缓冲性能好。微量元素和有机成分含量齐全且较丰富，是目前使用最广的培养基。
2、B5培养基（硝酸盐含量较高培养基）
为大豆组织培养设计的，铵的含量比较低、硝酸钾含量较高。
3、N6培养基（硝酸盐含量较高的培养基）
为水稻、小麦以及其他植物的花粉与花药培养中被广泛使用（朱至清等，1974），特点是硝酸钾、硫酸铵含量较高且不含钼。
4、White培养基（低无机盐类培养基）
一种无机盐类浓度较低的培养基，用途广泛，非常适合生根培养和幼胚的培养。
5、WPM培养基（木本植物培养基）
氮的含量比较低，无机盐含量也低，有利于木本植物组织的生长与分化。
三、培养基配制
（一）基本培养基母液
母液（stock solution）是指，把培养基中的各种大量元素用量扩大l0倍，微量元素、有机元素和激素等用量扩大l00倍，分别或混合溶解制成浓缩液。
无机盐类的母液可以在2-4℃冰箱中保存；维生素、氨基酸等有机物的母液在冷冻箱中保存；植物生长调节剂母液单独配制。
在配制母液时，应该把Ca2+与SO42-，Ca2+、Mg2+与PO43-放在不同的母液中，以免发生沉淀。一般铁盐也是单独母液，因为植物能够利用的是亚铁离子，并且不能长时间暴露于空气中。
木本植物生根需要IBA（生根效果最好），但是保存条件更加苛刻：需要冷冻避光、过滤灭菌。
人工合成的植物激素不一定就可以高压灭菌。比如IBA不能高压灭菌，而NAA可以高压灭菌。
（二）培养基配制的步骤
- 加入除了琼脂外的物质，溶解后定容；
- 定容后再加入琼脂，加热完全溶解；
- 然后调整pH值。
第四节 培养条件
一、温度
一般为25℃；最高不高于35℃，最低不低于15℃。
二、光照
1、光强：1000-6000lux
2、光质：对细胞分裂和器官分化有很大的影响，比如白光、蓝光、红光；
3、光周期：16h/天
三、湿度
在培养初期瓶内湿度接近100%，随着培养时间的推移，水分逐渐逸失。
培养室内的相对湿度常年保持在70-80%为宜。
四、培养基的营养物质和pH变化
一般而言，pH为5.7-5.8。营养物质减少，pH改变。
过酸过碱均不利于组织生长。
兰花宜偏酸些，pH5.2甚至更小；玉米胚乳愈伤组织在pH7.0鲜重增长最快；pH6.1干重增长最快。
五、气体
氧气：缺氧时不利于组织生长；
二氧化碳：含量过高时不利于组织生长；无糖培养时要加大二氧化碳浓度；
乙烯：含量过高时不利于组织生长。
上世纪我国科学家植物组织培养中的贡献
罗士韦、崔澂、刘继侗、李正理
崔澂：首次发现了嘌呤类化合物对植物细胞再分化芽生成的促进作用，为细胞分裂素的发现以及揭示生长素与细胞分裂素调控器官分化这一植物生理学研究史上的里程碑做出了早期且重大的贡献。