第一节 植物细胞培养
植物细胞培养：将植物单细胞或细胞团直接在培养基中进行培养的一种培养方式。
植物细胞培养特点及用途：
1、操作简单、重复性好、群体大、突变体筛选、遗传转化
2、进行细胞生理代谢及各种不同物质对细胞代谢的影响研究
3、通过单细胞的克隆化，即“细胞株”，可以把微生物遗传技术用于高等植物，进行农作物改良;
4、细胞增殖速度快，适合大规模悬浮培养。如同微生物一样，应用到发酵工业，生产一些特有产物，如植物次生代谢产物，包括各种药材的有效成分，用于医药业、酶工业、天然色素工业，这是植物产品工业化生产的新途径。
一、单细胞培养
（一）单细胞分离：植物器官或愈伤组织
1、由植物器官分离
1）机械法：通过机械磨碎、切割等操作获得游离细胞的方法。
优点：细胞不会受到酶的伤害作用、无需质壁分离、利于生理和生化研究
缺点：不能普遍适用，只适宜于薄壁组织排列松散，细胞间接触点很少的材料；产量低，不易获得大量活性细胞
2）酶解法：选用专一性水解酶，温和条件下处理叶片，降解细胞中胶层，使得细胞彼此分开获得游离细胞的方法。
2、由愈伤组织分离（多用）
未分化、易散碎的愈伤组织进行震荡培养，获得悬浮细胞液，然后再过滤
（二）单细胞培养
对分离得到的单个细胞进行培养，诱导其分裂增殖，形成细胞团，再通过细胞分化形成芽、根等器官或胚状体，直至长成完整植株的技术。
单细胞培养对获得单细胞克隆(细胞株)是非常重要的。
单细胞培养难度较大，必须采用一些特殊的培养技术才能保证成功。
平板培养法、看护培养法、微室培养法、条件培养基培养。
1、平板培养法
平板效率：将一定密度的悬浮单细胞接种到一薄层固体培养基中进行培养的技术。
常用植板效率衡量细胞培养效果：成细胞团的细胞数占植板细胞总数的百分数
平板培养注意事项：
3、微室培养法
指人工制造一个微室，将单细胞培养在微室中的少量培养基中，使其分裂增殖形成细胞团的方法。
4、条件培养基培养法
指在培养基中加入高密度的细胞进行培养，一定时间后这些细胞就会向培养基中分泌一些物质，使得培养基条件化。
二、细胞的悬浮培养
1、概念：指将游离的单细胞或细胞团按照一定的细胞密度悬浮在液体培养基中进行培 养的方法。
2、同步分裂、增殖迅速的大量细胞，可用于大规模的工业化生产
3、培养方法：分批培养（液体培养基中），半连续培养（培养罐），连续培养（封闭型和开放型）
4、培养基
1) 不加琼脂
2) 调节生长物质比例，提高细胞分散程度
3) 无机磷酸盐-限制因子
4) 培养基振荡
5、培养细胞的同步化
是指大多数细胞都能同时通过细胞周期的各个时期，以研究细胞分裂和细胞代谢等。
分为物理方法（低温休克法）、化学方法（饥饿法和化学试剂抑制法）
三、影响单细胞培养的因素
培养基成分、细胞植板密度（1x104-1x105）细胞/ml、植物生长调节剂、pH和CO2、渗透压、振荡频率、培养条件。
四、植物细胞培养的应用
生产天然植物成分（药物、色素等）、生物转化、细胞的工厂化生产、构建生物反应器、筛选突变体、再生植株能力强、获取商业细胞系、植物育种、人工种子、研究材料
第二节 植物体细胞无性系变异
一、体细胞无性系变异
体细胞无性系 (somaclone)：任何形式的细胞培养所产生的再生植株统称为体细胞无性系，由细胞培养所获得的再生植株。
体细胞无性系变异(somaclonal variation)：在培养阶段发生变异，进而导致再生植株亦发生遗传改变的现象。即体细胞无性系植株所表现出来的变异。广泛存在于各种再生途径(体细胞胚胎发生途径和器官发生途径)。
无性系变异包括表型变异（包括形态特征、生长习性、抗性等）、染色体变异（数目：整倍性变异、非整倍性变异，结构：缺失、互换、易位、倒位）、DNA结构变异（遗传变异、表观遗传变异）
体细胞无性系优点：
缺点：
应用前景：
1、改良作物品种、拓宽种质资源：选育优质作物、抗性新细胞系、品系
2、加强外源基因向栽培种的渐渗：提高外源基因向栽培种渐渗
3、遗传学研究：利用体细胞无性系变异来研究细胞培养、诱变中的遗传规律，不用占用耕地，不受地理、气候等条件的影响。可以缩短研究周期，提高工作效率。
4、发育生物学研究：对植物发育的基因调控研究
5、生化代谢途径研究：进行生化代谢途径的研究，也可进行代谢工程修饰改造，使代谢过程按照人类需要进行
存在问题：
1、受组织培养技术的限制，不能应用于再生体系尚未建立的植物。
2、选出的细胞系的变异特性，并不是都能在后代中继续表达或稳定遗传。
3、到目前为止，体细胞无性系变异仍是一个随机的过程，很难预测自然发生的体细胞无性系变异。
二、体细胞无性系变异机理及影响因素
1、机理
2、影响变异因素
（1）外植体的遗传特性：植物基因型、倍性水平、植物种类
（2）供体植物生理状态：以分生组织为外植体的再生植株体细胞变异频率很低；以分化组织为外植体的再生植株容易变异
（3）培养基成分：激素浓度和不同激素配比
（4）培养基状态：一般来讲，悬浮培养的细胞较半固体培养的细胞易产生变异
（5）组织原有的倍性：单倍体组织的二倍化现象比二倍体组织的四倍化现象更为常见
（6）继代培养时间：长时间继代培养会使愈伤组织和细胞的变异频率增加, 再生能力降低或丧失
（7）培养类型：原生质体培养的体细胞变异>细胞培养>组织器官培养；性细胞培养的变异>体细胞培养
（8）温度：高温或低温能促进染色体变异
（9）光照：紫外线与射线会增加变异的频率
（10）化学元素与激素：有毒元素容易诱导无性系的变异
第三节 植物种质资源保存
种质(germplasm)：决定生物性状的遗传物质。
种质资源：携带种质的载体。狭义：一个植株或某个器官；广义：由不同基因型所组成的群体。
植物种质离体保存：指对离体培养的小植株、器官、组织或细胞等，采用限制、延缓或停止其生长的方法进行保存，需要时可恢复其生长，并能再生完整植株。
植物种质资源保存方式：原生境保存，非原生境保存（移地保存、种质库保存、离体保存）
一、植物限制生长离体保存方法
1、限制生长离体保存是以组织培养技术为基础，通过改变试管苗或组织的生长环境，使培养物生长降至最小限度，延长继代间隔时间，有效保证种质的遗传稳定性，实现种质中期保存的方法。
有低温、高渗透压、生长延缓剂、低氧分压等方法。
2、低温保存方法: 低温保存时限制生长方法中应用最广的方法，通过降低温度，减弱甚至几乎完全停止培养物生命活动，达到抑制其生长的目的。
3、高压渗透保存方法: 通过提高培养基渗透压，影响离体培养物吸收作用从而延缓 其生长，达到抑制培养物生长速度的保存方法。
4、超低温离体保存是指在低于-80度的低温条件下对植物器官、组织或细胞进行离体保存的技术。这是一种不需要继代的长期保存植物种质的有效方法。液氮最为常用。
5、优点：遗传性稳定、长期保持再生能力、保存不稳定的培养物、长期保存无病毒种质、延长花粉寿命、便于国际间交换、设备简单、成本低
6、保存原理：在这样的低温条件下，使溶液通过快速冷却或减少冰晶形成形成玻璃态冰，既没有溶液效应对细胞的伤害，也没有因冰晶形成对细胞造成机械伤害，并且植物材料的代谢和生长基本停止，可有效保持其遗传稳定性，同时又不会丧失其形态发生的潜能。
7、植物种质超低温保存时需注意：
(1)选择胞内自由水少、抗冻能力强的材料;
(2)采用预处理措施，提高材料抗冻能力;
(3)尽量减少冰晶形成，避免细胞过度脱水;
(4)解冻过程避免冰晶重新形成即温度冲击导致的渗透冲击等。
8、常见的保护剂种类：渗透型（甘油、二甲基亚砜DMSO等）、非渗透型（蔗糖、聚乙二醇等）
9、冷冻保护剂的作用：提高溶液的水合作用，降低冰点温度，减少冰晶形成和增长速度；增加细胞膜透性，加速细胞内的水分流到细胞外，防止细胞内结冰；对细胞膜系统起保护作用。
10、超低温冻结保存的基本方法：预冷却冻结法、玻璃化法、包埋脱水法
11、影响冷冻后存活率的因素
（1）植物材料(培养物)选取
（2）材料预处理：低温锻炼、预培养
（3）冷冻处理：慢冻法、干冻法、快冻法
（4）保存液
（5）冷冻储存：液氮
（6）解冻
（7）洗涤
（8）再培养
12、存活率测定
FDA染色法(二醋酸酯荧光素染色法)、再生培养法、TTC法(氯化三苯基四氮唑还原法)
13、遗传检测
形态特征变化、染色体变化、分子标记