11植物遗传转化及其他生物技术

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第一节 植物遗传转化

1、转基因的受体材料:新鲜的块茎、茎段、叶片(子叶)、叶柄、原生质体、愈伤组织、胚性愈伤组织和胚性悬浮细胞等。
(1)叶片(子叶)、叶柄、茎段受体:优点:取材方便、重复性好、具再生能力。缺点:该类受体存在嵌合体和不同基因型间再生频率差异较大等问题。
(2)块茎、块根、鳞茎受体:该受体具有再生时间短、转化再生植株育性好、外植体来源广等优点。该类受体也存在嵌合体和不同基因型间再生频率差异较大等问题。
(3)原生质体受体:原生质体具有遗传上的一致性,易于接受各种外来遗传物质, 也是适宜的转化受体材料。优点是获得的转化植株来自一个转化细胞,减少嵌合体发生,具有重要应用价值。缺点是技术要求高,转化植株再生的成功率也极显著地低于其他方法,操作复杂。
(4)胚状体:是良好的转基因受体,其突出的优点在于胚状体的单细胞起源性,因而可以有效避免嵌合体现象。
(5)悬浮细胞液
(6)愈伤组织
(7)活体受体(in vivo inoculation):在活体条件下给受体植物造成创伤,用携带外源基因的农杆菌感染植株伤口,使外源基因导入受体植物的方法。
活体受体的关键:必须在植株上形成新鲜伤口,并使用感染力强的工程菌。
2、植物表达载体(plant expression vector)是指携带目的外源基因进入植物细胞进行扩增和表达的媒介,又称工程载体。
3、植物表达载体主要分为农杆菌Ti质粒载体和植物病毒载体两大类,还有RNA干扰表达载体。
4、农杆菌主要有根癌农杆菌和发根农杆菌两种
5、双元载体系统:用两个质粒,一种含有T-DNA的左右边界区(vector1);另一种含有vir区(vector2)
6、影响农杆菌T-DNA转移的因素
菌株、生长时期、基因活化的诱导物(乙酰丁香酮,AS)、外植体类型和生理状态、外植体和农杆菌共培养时间
7、RNA干扰 (RNA interference, RNAi)是指一些小的双链RNA (dsRNA)能高效/特异地阻断体内特定基因表达,促使mRNA降解,使细胞表现出特定基因缺陷表型过程。

第二节 植物遗传转化方法

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农杆菌载体介导转化法、载体直接或无载体基因导入法、活体转化法
载体直接或无载体导入法:通过物理和化学方法将插入目的基因的载体或外源基因直接导入植物细胞。基因枪法、聚乙二醇法(原生质体)、显微注射法等
活体转化法:通过植物的活体组织,如花粉管通道、子房等受体,或通过侵染性病毒(含目的基因载体)进行活体植株侵染,实现外源基因的导入。
花粉管通道转化法:是利用花粉管伸长进入胚囊的过程, 使外源DNA能沿花粉管渗入,经 过珠心通道进入胚囊,转化尚不具 备正常细胞壁的卵、合子或早期胚 胎细胞
子房注射转化法:子房注射转化法是简便易行的植物转基因方法;和花粉管通道法一样,转化时间的选择很关键
病毒载体活体侵染转化法、Floral-dip转化法(农杆菌介导的)

第三节 转基因植株鉴定方法及安全性

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1、报告基因是指其编码产物能够被快速地测定,用来判断外源基因是否成功地导入受体细胞、组织或器官,并检测其表达活性的一类特殊用途的基因。
2、常用报告基因:β葡萄糖醛酸乙酰转移酶基因(gus)、绿色荧光蛋白基因(green fluorescent protein, gfp)
3、报告基因特征:编码产物是唯一的,并对受体细胞无毒;表达产物及产物的类似功能在未转化的细胞中不存在,即无背景;产物表达稳定,便于检测